Kromatografi Lapis Tipis-Densitometri

A. PENDAHULUAN 

Pada perkembangan metode Kromatografi saat ini pemakaian "Thin Layer Chromato Scanner" yang lebih dikenal dengan nama densitometer makin banyak dipakai secara luas oleh peneliti/ilmuwan. 

Densitometri adalah metode analisi instrumental yang berdasarkan interaksi radiasi elektromagnetik dengan analit yang merupakan bercak atau noda pada lempeng KLT.

Interaksi radiasi elektromagnetik dengan noda pada lempeng KLT yang ditentukan adalah adsorpsi, transmisi, pantulan (refleksi) pendar fluor atau pemadaman pendar fluor dari radiasi semula. Keunggulannya adalah dititikberatkan untuk analisis analit-analit dengan kadar sangat kecil yang perlu dilakukan pemisahan terlebih dahulu dengan KLT.
Metode ini yang banyak diguanak dalam analisis kualitatif maupun kuantitatif di bidang farmasi terutama di bidang analisis obat bahan alam.

B. TEORI DASAR 

Kromatografi Lapis Tips (KLT) merupakan metode pemisahan komponen-komponen atas dasar perbedaan adsorpsi atau partisi oleh fase diam di bawah ngerakan pelarut pengembang/pengembang campur.

Fase Diam 

Bahan padat pada penyangga : pelat elas/logam atau plastik dengan ketebalan 0,25 mm. Fase diam yang banyak dipakai : silika gel yang dicampur CaSO4 ; adsorben lain yang juga banyak dipakai : alumnia, kieselguhr, celite, serbuk  selulose, serbuk poliamida, kanji dan sephadex.

Jenis fase diam : sama seperti pada KCKT dikenal beberapa macam sifat polaritas. Silikal gel dikenal sebagai fase diam polar, yang dapat dibuat menjadi non polar (RP = Reversed Phase) setelah dilakukan pengikatan hidroksilnya dengan : C2, C8, atau C18.

Mekanisme pemisahan adalah : adsorpsi,partisi, penukar ion atau fase terbalik (adsorpsi-partisi). Apabila sampel bersifat non polar maka pelarut pengembangnya non polar. Sedangkan bila sample bersifat polar, maka pelarut pengembangnya bersifat polar.

Ukuran fase diam 1-25 million dalam keadaan uniform/seragam, akan menghasilkan pemisahan baik dan aliran fase gerak cepat dan merata.
Pada prinsipnya pemisahan KLT diusahakan dilakukan dalam keadaan netral.

 

Image 1 : KLT

Image 2 : Thin Layer Chromatography

Profil Kromatogram


Kromatogram KLT akan tampak setelah visualisasi dengan cara fisika atau kimia. Bila proses pemisahan baik akan menghasilkan bercak atau noda bulat. Bila pemisahan kurang sempurna bercak atau noda berekor, penyebabnya antara lain : pemilihan fase gerak yang tidak tepat dan ketidakjenuhan chamber.

Penotolan sample dengan mikropipet dan selama eluasi suhu harus dijaga, karena kenaikan suhu berpengaruh kepada R_f. 

Image 3 : Kromatografi Kertas Menaik

Image 4 : Kromatogram

_{Faktor retardasi : Rf} 

_{adalah jarak migrasi komponen (bercak) dibagi jarak migrasi fase gerak} 

 
R_{f = dR / dM = hRf / 100}

_Desintometri 

_{S. Levi dan R Reisfeld telah mengangkat metode densitometri ke tingkat analisis kuantitatif ultra mikro. Keduanya telah berhasil menentukan antara lain testosterone dalam cairan biologis pada rentang kadar 1-250 ng, dan kolesterol 4 -150 ng dengan pendar fluor pada noda (kromatogram) KLT.}  

_{Prinsip penentuan dengan metode desintometri hampir sama dengan metode spektrofotometri.} 

_{Penetuan kadar analit yang dikorelasikan dengan area / luas noda pada KLT akan lebih terjamin kesahihannya dibanding dengan metode KCKT atau KGC, sebab area noda kromatogram diukur pada posisi diam atau "zig-zag" menyeluruh.} 

_{Persamaan Kubelka-Munk} 

_{Secara teoritis Kubelka dan Munk telah berhasil menerangkan mengapa hubungan antara kadar analit yang dirajah terhadap area / luas kromatogram tidak merupakan garis lurus. Menurut kedua ilmuwan tersebut,  apabila radiasi elektromagnetik (REM) dengan intensitas semula (I) jatuh pada permukaan lapis tipis yang tidak homogen dengan arah rambatan tegak lurus, maka sebagian dari REM tersebut direflesikan} (I_s) dan sebagian diserap oleh analit lapisan tipis (I₀) dan sebagian lagi diteruskan (I_t). 

I = I_{0 +} I_s + I_t 

_{Intensitas REM yang direfleksikan tergantung pada koefisien permukaan lapis tips (E) yang dinyatakan sebagai}  

_{Is = I. E}

_{Harga E sangat dipengaruhi oleh jenis lapisan tipis yang dipakai. Selanjutnya akan didapat :} 

I_{0 = I -Is}
I_{0 = I - I.E = (1-E)}

_{Apabila lapisan tipis tersebut merupakan lapisan tipis yang homogen maka akan berlaku hukum Lambert-Beer seperti pada spektrofotmetri.} 

_{It =} I₀.e^-K.x 

^{x = tebal medium lapis tipis , K = koefisien adsorpsi. Harga e-K.x menyatakan berkurangnya intensitas REM yang melewati medium. 
Harga tersebut dikenal juga sebagai kerapatan optik atau "optical density" dan medium yang dilewati REM. 
Pada semua pelat KLT tidak memberikan homogenitas fase diam karena keitdaksamaan partikel-partikel fase diamnya disamping kerja penyerapan REM juga terjadi percikan radiasi oleh partikel fase diam.} 
  

_{Pada metode Spektrofotodensitometri / densitometri dikenal parameter :} 

_{K = (Koefisien penyerapan)} 

_{S = (Koefisien penghamburan)} 

_{Karena parameter S itulah terjadi penurunan intensitas radiasi yang masuk ke medium lapis tipis karena hilangnya intenstitas radiasi (dihamburkan) oleh partikel-partikel fase diam. Di sinilah letaknya mengapa terjadi lengkung pada Kurva teoritas "Kubelka-Munk"} 

Image 5 : Kurva Kubelka-Munk

_{Setiap pelat KLT yang dipakai memberikan harga SX bebrbeda (tiap merek berbeda) harga SX berkisar : 0-10} 

_{Spektro densitometer (Thin Layer Chromato Scanner) modern dilengkapi mikro komputer dengan harga operasional SX = 0-3 untuk melinearkan kurva teoritis Kubelka-Munk} tanpa mempersoalkan SX lagi. 

 

<sub>C. INSTRUMENTASI 

Komponen penting dari densitometer antara lain :</sub> 

_{1. Sumber radiasi (Source), pengatur panjang gelombang (}λ selector), beam spliter, thin layer plate (end view), detector phototube (transmitance position) 

Sumber radiasi ada 3 macam tergantung rentang panjang gelombang dan prinsip penentuan. 

Pada umumnya densitometri memberikan rentang gelombang penentuan 200-630 nm. Lampu Deuterium (D_{2) dipakai untuk pengukuran pada daerah cahaya tampak.} 

_{Untuk penetapan pendar fluor dan pemadaman pendar fluor dipakai lampu busur Hg bertekanan tinggi. Sama seperti pada spektorfotometri, pada densitometri juga dilakukan penentuan transmisi atau adsorpsi dan refleksi pada panjang gelombang maksimal.} 

_{Pada penetapan pendar fluor dan pemadaman pedar fluor juga harus dilakukan pada panjang gelombang dimana terjadi emisi} atau intensitas realitif pendar fluor yang optimal. 

_{Monokromator dengan fungsi yang sama seperti pada spektrofotometri UV-Vis yang diperlukan pada densitometer. Biasanya dipakai monokromator kisi difraksi 1200 garis/mm.} 

_{Detektor PMT Photo Multiplier Tube = Tabung Penggandaan Foto) merupakan detektor umum yang dipakai pada densitometer.} 

_{D. APLIKASI} 

_{Metode KLT-Densitometri digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif.} 

_{Analisis Kualitatif} 

_{Analisis kualitatif dengan KLT-Densitometri pada prinsipnya mengacu kepada nilai Rf (Retardation factor) atau Faktor retardasi yaitu : membandingkan Rf analit dengan Rf baku pembanding} atau membandingkan bercak kromatogram sample dengan kromatogram "Reference Standart" yang dikenal dengan : Factro Retensi Relatif (Rx) 

_{Untuk penentuan kualitatif dengan Rs harus dilakukan bersamaan dengan sample pada pelat yang sama.} 

_{Analisis Kuantitatif} 

_{Analisis kuantitatif hampir sama dengan spektrofotometri, penentuan kadar analit dikorelasikan dengan area bercak pada pelat KLT.} 

_{Cara penetapan kadar dapat dilakukan dengan :} 

_{1. Membandingkan area bercak analit dengan area bercak baku pembanding yang diketahui konsentrasinya.}

_{Cx = Ax / Ap x Cp}

_{Cx = konsentrasi analit}

_{Ax = area analit} 

_{Ap = area baku pembanding}

_{Cp = konsentrasi baku pembanding} 

_{2. Kurva kalibrasi :}

_{Kurva kalibrasi dibuat dengan cara memplot area bercak terhadap konsentrasi dari satu seri larutan baku pembanding. Kurva yang tebentuk harus linear, kemudian dengan persamaan garis regresi dapat ditentukan kadar analit.} 

_{Video di atas adalah video Thin Layer Chromatography ;)}