Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
(KCKT) atau High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan salah satu
metode fisikokimia berdasarkan pada teknik kromatografi di mana fase geraknya
berupa cairan dan fase diam dapat dalam bentuk cair atau padat.
Metode ini sangat bermanfaat di
bidang farmasi untuk menganalisis secara simultan beberapa analit dalam martiks
sederhana maupun kompleks.
Pada akhir 1960-an, semakin banyak
usaha untuk pengembangan kromatografi cair sebagai suatu teknik untuk
mengimbangi kromatografi gas. KCKT adalah kromatografi cair kolom modern, yang
dasarnya merupakan pengembangan dari kromatografi kolom menjadi suatu sistem
pemisahan yang cepat dan efisien.
Peningkatan kecepatan dan efisiensi
pemisahannya terkait dengan peningkatan performa kolomnya yang menggunakan
kolom dengan ukuran dimensi dan partikel yang jauh lebih kecil dari kolom yang
dipakai pada kromatografi kolom, sehingga agar fase gerak dapat mengalir pada
kolom, fase gerak dipompa dengan tekanan tinggi. Di samping itu, kinerja
tingginya dalam analisis didukung dengan adanya berbagai sistem deteksi dengan
kepekaan tinggi yang dapat diintegrasikan dengan sistem kromatografinya.
KCKT dapat dipandang sebagai
pelengkap Kromatografi gas (KG), keduanya dapat digunakan untuk menghasilkan
efek pemisahan yang sama baiknya. Bila derivatisasi diperlukan dalam KG, namun
pada KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat
yang labil pada pemanasan atau tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun
demikian bukan berarti KCKT menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan
lebih besar dalam analisis.
KCKT menawarkan beberapa keuntungan
dibanding dengan metode kromatografi lainnya, antara lain :
a) Cepat :: waktu analisis umumnya
kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikan sekitar 15-30 menit.
Untuk analisis yang uncomplicated waktu analisis kurang dari 5 menit
bisa dicapai.
b) Resolusi tinggi :: berbeda dengan
KG, interaksi selektif dapat terjadi pada KCKT karena pengaruh yang besar dari
fase diam dan fase geraknya.
c) Sensitivitas detektor :: detektor
absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumlah
nanogram (10-9 gram) dari bermacam-macam zat. Detektor-detektor fluoresensi dan
elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram).
d) kolom dapat digunakan kembali ::
berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali.
Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama sehingga satu kolom
dapat digunakan berulang kali untuk berbagai jenis sampel.
e) Ideal untuk zat termolabil dan
volatilitas rendah :: zat-zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG karena
terurai oleh suhu tinggi atau volatilitasnya rendah dan dapat dianalisis
secara KCKT.
f) Mekanisme pemisahan lebih
variatif :: banyaknya pilihan fase gerak dan fase diam yang digunakan serta
besarnya interaksi analit terhadap fase diam dan fase gerak memungkinkan
terjadinya pemisahan dengan berbagai mekanisme.
g) Mudah rekoveri sampel :: umumnya
detektor yang digunakan dalam KCKT tidak menyebabkan kerusakan pada komponen sampel
yang diperiksa, sehingga komponen sampel tersebut dapat dengan mudah
dikumpulkan setelah melewati detektor.
Namun, jika dibandingkan dengan
kromatografi lapis tipis kinerja tinggi, KCKT memiliki beberapa kelemahan,
yaitu :
1. Tidak dapat menganalisis lebih
dari satu jenis sampel sekaligus
2. Kromatogram tidak dapat disimpan
sebagai dokumen otentik
Kromatografi cair kinerja tinggi
merupakan suatu metode pemisahan canggih dalam analisis farmasi yang dapat
digunakan sebagai uji identitas, uji kemurnian dan penetapan kadar. Titik
beratnya adalah untuk analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap dan
tidak stabil pada suhu tinggi, yang tidak bisa dianalisis dengan metode KG.
Banyak senyawa yang dapat dianalisis dengan KCKT mulai dari senyawa ion
anorganik sampai senyawa organik makromolekul. Untuk analisis dan pemisahan
obat/bahan obat campuran rasemis optis aktif dikembangkan suatu fase pemisahan kiral
yang mampu menetukan rasemis dan isomer aktif.
Walaupun disadari biaya yang
dibutuhkan untuk analisis dengan KCKT sangat mahal, namun metode ini tetap
dipilih untuk digunakan menganalisis 277 obat / bahan obat karena hasil
analisis yang memiliki akurasi dan presisi yang tinggi dalam waktu analisis
yang cepat.
Setelah 4 kali postingan tentang teori dasar kromatografi, skrg waktunya untuk memperdalam pengetahauan sobat-sobat sekalian yang sudah membaca artikel di blog saya selama 4 bulan ini..
Di postingan kelima ini saya akan memberikan beberapa soal yang berkaitan dengan artikel-artikel yang sudah saya ulas di blog ini, tentunya mengenai kromatografi.
Ada kunci jawabannya juga, so saya harap posting kali ini bisa membantu sobat-sobat sekalian ......
1) Kromatografi adalah kelompok metode penting yang meliputi ...
a. Pemisahan, identifikasi dan penetapan komponen-komponen dari campuran yang kompleks
b. Identifikasi dan penetapan kadar campuran yang kompleks
c. Pemisahan komponen-komponen dari campuran yang kompleks
d. Pemisahan dan penetapan komponen-komponen dari campuran yang kompleks
e. Penetapan kadar campuran yang kompleks
Jawaban : A
2) Pada semua pemisahan secara kromatografi, sampel dilarutkan dalam fase gerak , yang dapat berupa ...
a. Zat cair dan padatan
b. Cairan dan gas
c. Gas, cairan atau supercritical fluid
d. Gas inert dan zat cair polar
e. Zat cair non polar dan gas
Jawaban : C
3) Orang yang pertama kali memberikan istilah "kromatografi" terhadap hasil pemisahannya yang dilakukan pada pigmen-pigmen tanaman seperti klorofil dan ksantofil adalah ...
a. Martin dan Synge
b. Ramsey dan Csaba Hovarth
c. Tswett dan Martin
d. Mikhail Tswett
e. Izamailov dan Shraiber
Jawaban : D
4) Salah satu pembagian kromatografi adalah berdasarkan fase geraknya yaitu fase gerak cair dan gas dengan contoh sebagai berikut ...
a. KCKT dan KLT-Densitometri
b. HPLC dan GLC
c. HPLC dan HPTLC
d. GSC dan GLC
e. TLC dan LLC
Jawaban : B
5) Metode di bawah ini yang tidak termasuk metode pemisahan fisik zat yang berdasarkan perbedaan migras / distribusi masing-masing komponen campuran di antara fase diam dan fase gerak adalah ...
a. Kromatografi gas
b. Elektroanalitik
c. KCKT
d. KLT-Densitometri
e. GLC
Jawaban : B
6) Mekanisme pemisahan analit di antara dua fase
kromatografi berdasarkan atas perbedaan ...
a. Kelarutan
b. Ukuran molekul
c. Adsorpsi
d. Partisi
e. Distribusi/migarsi
Jawaban : E
7) Waktu retensi (t atau tR) adalah ...
a. perbandingan waktu rambat bercak dihitung dari pusat penotolan hingga pusat bercak dibagi waktu rambat fase gerak
b. waktu yang diperlukan oleh suatu zat (analit) mulai dari penyuntikan hingga keluarnya maksimum dari puncak zat tersebut
c. waktu retensi yang lebih besar dibagi dengan waktu retensi yang lebih kecil dari dua analit
d. waktu yang diperlukan oleh suatu zat (analit) mulai dari penyuntikan hingga selesai waktu analisis
e. sama dengan waktu retensi relative
Jawaban : B
8) Dari grafik van Deemter, dapat diketahui ...
a. suhu optimum
b. resolusi
c. HETP
d. suhu maksimum
e. flow rate optimum
Jawaban : C
9) Nilai resolusi dari pemisahan kromatografi berikut, yang terbaik adalah ...
a. R = 0,25
b. R = 0,50
c. R = 0,75
d. R = 0,100
e. R = 1,5 Jawaban : E
10) Ada 2 cara untuk analisis perhitungan kuantitas analit pada kromatogram yaitu ...
a. mengukur tinggi puncak kromatogram dan dengan menetukan area / luas puncak kromatogram
b. menentukan waktu retensi dan faktor retardasi
c. menentukan jarak rambat fase gerak
d. hanya dengan menetukan area / luas puncak kromatogram
e. mengukur tinggi puncak kromatogram
Jawaban : A
11) Uji kualitatif suatu senyawa menggunakan metode KLT dilakukan dengan ...
a. membandingkan diameter bercak sampel dengan bercak baku pembanding
b. membandingkan intensitas fluoresensi sample dengan baku pembanding
c. membandingkan nilai Rf sample dengan pustaka
d. membandingkan area puncak sampel dengan area baku pembanding
e. membandingkan nilai Rf sampel dengan baku pembanding Jawaban : E
12) Faktor retardasi ; Rf adalah ...
a. jarak migrasi komponen dibagi jarak migrasi fase diam
b. jarak migrasi komponen dibagi jarak migrasi fase gerak
c. jarak rambat komponen sampel
d. jarak yang ditempuh fase gerak dibandingkan jarak komponen
e. jarak migrasi fase gerak dibagi jarak migrasi komponen Jawaban : B
13) Identifikasi suatu zat secara KLT didasarkan atas nilai ...
a. Retardation factor
b. warna bercak
c. waktu retensi
d. area puncak
e. tinggi puncak
Jawaban : A
14) Analisis semi kuantitaif secara KLT didasarkan atas ...
a. intensitas warna bercak
b. Ratio of Front
c. warna bercak
d. jarak rambat
e. tinggi bercak
Jawaban : A
15) Suatu analit dianalisis secara KLT, bercaknya teramati 6 cm dari titik penotolan. Bila jarak rambatnya 8 cm, maka nilai hRf-nya adalah ...
a. 1,33
b. 13,3
c. 133
d. 7,5
e. 75 Jawaban : E
Sampai di sini dulu ya sobat-sobat, di bawah ini contoh-contoh kromatografi .. Checkitout :)
Pada perkembangan metode Kromatografi saat ini pemakaian "Thin Layer Chromato Scanner" yang lebih dikenal dengan nama densitometer makin banyak dipakai secara luas oleh peneliti/ilmuwan.
Densitometri adalah metode analisi instrumental yang berdasarkan interaksi radiasi elektromagnetik dengan analit yang merupakan bercak atau noda pada lempeng KLT.
Interaksi radiasi elektromagnetik dengan noda pada lempeng KLT yang ditentukan adalah adsorpsi, transmisi, pantulan (refleksi) pendar fluor atau pemadaman pendar fluor dari radiasi semula. Keunggulannya adalah dititikberatkan untuk analisis analit-analit dengan kadar sangat kecil yang perlu dilakukan pemisahan terlebih dahulu dengan KLT.
Metode ini yang banyak diguanak dalam analisis kualitatif maupun kuantitatif di bidang farmasi terutama di bidang analisis obat bahan alam.
B. TEORI DASAR
Kromatografi Lapis Tips (KLT) merupakan metode pemisahan komponen-komponen atas dasar perbedaan adsorpsiatau partisi oleh fase diam di bawah ngerakan pelarut pengembang/pengembang campur.
Fase Diam
Bahan padat pada penyangga : pelat elas/logam atau plastik dengan ketebalan 0,25 mm. Fase diam yang banyak dipakai : silika gel yang dicampur CaSO4 ; adsorben lain yang juga banyak dipakai : alumnia, kieselguhr, celite, serbuk selulose, serbuk poliamida, kanji dan sephadex.
Jenis fase diam : sama seperti pada KCKT dikenal beberapa macam sifat polaritas. Silikal gel dikenal sebagai fase diam polar, yang dapat dibuat menjadi non polar (RP = Reversed Phase) setelah dilakukan pengikatan hidroksilnya dengan : C2, C8, atau C18.
Mekanisme pemisahan adalah : adsorpsi,partisi, penukar ion atau fase terbalik (adsorpsi-partisi). Apabila sampel bersifat non polar maka pelarut pengembangnya non polar. Sedangkan bila sample bersifat polar, maka pelarut pengembangnya bersifat polar.
Ukuran fase diam 1-25 million dalam keadaan uniform/seragam, akan menghasilkan pemisahan baik dan aliran fase gerak cepat dan merata.
Pada prinsipnya pemisahan KLT diusahakan dilakukan dalam keadaan netral.
Image 1 : KLT
Image 2 : Thin Layer Chromatography
Profil Kromatogram
Kromatogram KLT akan tampak setelah visualisasi dengan cara fisika atau kimia. Bila proses pemisahan baik akan menghasilkan bercak atau noda bulat. Bila pemisahan kurang sempurna bercak atau noda berekor, penyebabnya antara lain : pemilihan fase gerak yang tidak tepat dan ketidakjenuhan chamber.
Penotolan sample dengan mikropipet dan selama eluasi suhu harus dijaga, karena kenaikan suhu berpengaruh kepada Rf.
Image 3 : Kromatografi Kertas Menaik
Image 4 : Kromatogram
Faktor retardasi : Rf
adalah jarak migrasi komponen (bercak) dibagi jarak migrasi fase gerak
Rf = dR / dM = hRf / 100
Desintometri
S. Levi dan R Reisfeld telah mengangkat metode densitometri ke tingkat analisis kuantitatif ultra mikro. Keduanya telah berhasil menentukan antara lain testosterone dalam cairan biologis pada rentang kadar 1-250 ng, dan kolesterol 4 -150 ng dengan pendar fluor pada noda (kromatogram) KLT.
Prinsip penentuan dengan metode desintometri hampir sama dengan metode spektrofotometri.
Penetuan kadar analit yang dikorelasikan dengan area / luas noda pada KLT akan lebih terjamin kesahihannya dibanding dengan metode KCKT atau KGC, sebab area noda kromatogram diukur pada posisi diam atau "zig-zag" menyeluruh.
Persamaan Kubelka-Munk
Secara teoritis Kubelka dan Munk telah berhasil menerangkan mengapa hubungan antara kadar analit yang dirajah terhadap area / luas kromatogram tidak merupakan garis lurus. Menurut kedua ilmuwan tersebut, apabila radiasi elektromagnetik (REM) dengan intensitas semula (I) jatuh pada permukaan lapis tipis yang tidak homogen dengan arah rambatan tegak lurus, maka sebagian dari REM tersebut direflesikan (Is) dan sebagian diserap oleh analit lapisan tipis (I0) dan sebagian lagi diteruskan (It).
I = I0 + Is + It
Intensitas REM yang direfleksikan tergantung pada koefisien permukaan lapis tips (E) yang dinyatakan sebagai
Is = I. E
Harga E sangat dipengaruhi oleh jenis lapisan tipis yang dipakai. Selanjutnya akan didapat :
I0 = I -Is
I0 = I - I.E = (1-E)
Apabila lapisan tipis tersebut merupakan lapisan tipis yang homogen maka akan berlaku hukum Lambert-Beer seperti pada spektrofotmetri.
It = I0.e-K.x
x = tebal medium lapis tipis , K = koefisien adsorpsi. Hargae-K.x menyatakan berkurangnya intensitas REM yang melewati medium. Harga tersebut dikenal juga sebagai kerapatan optik atau "optical density" dan medium yang dilewati REM. Pada semua pelat KLT tidak memberikan homogenitas fase diam karena keitdaksamaan partikel-partikel fase diamnya disamping kerja penyerapan REM juga terjadi percikan radiasi oleh partikel fase diam.
Pada metode Spektrofotodensitometri / densitometri dikenal parameter :
K = (Koefisien penyerapan)
S = (Koefisien penghamburan)
Karena parameter S itulah terjadi penurunan intensitas radiasi yang masuk ke medium lapis tipis karena hilangnya intenstitas radiasi (dihamburkan) oleh partikel-partikel fase diam. Di sinilah letaknya mengapa terjadi lengkung pada Kurva teoritas "Kubelka-Munk"
Image 5 : Kurva Kubelka-Munk
Setiap pelat KLT yang dipakai memberikan harga SX bebrbeda (tiap merek berbeda) harga SX berkisar : 0-10
Spektro densitometer (Thin Layer Chromato Scanner) modern dilengkapi mikro komputer dengan harga operasional SX = 0-3 untuk melinearkan kurva teoritis Kubelka-Munk tanpa mempersoalkan SX lagi.
C. INSTRUMENTASI Komponen penting dari densitometer antara lain :
1. Sumber radiasi (Source), pengatur panjang gelombang (λ selector), beam spliter, thin layer plate (end view), detector phototube (transmitance position)
Sumber radiasi ada 3 macam tergantung rentang panjang gelombang dan prinsip penentuan.
Pada umumnya densitometri memberikan rentang gelombang penentuan 200-630 nm. Lampu Deuterium (D2) dipakai untuk pengukuran pada daerah cahaya tampak.
Untuk penetapan pendar fluor dan pemadaman pendar fluor dipakai lampu busur Hg bertekanan tinggi. Sama seperti pada spektorfotometri, pada densitometri juga dilakukan penentuan transmisi atau adsorpsi dan refleksi pada panjang gelombang maksimal.
Pada penetapan pendar fluor dan pemadamanpedar fluor juga harus dilakukan pada panjang gelombang dimana terjadi emisi atau intensitas realitif pendar fluor yang optimal.
Monokromator dengan fungsi yang sama seperti pada spektrofotometri UV-Vis yang diperlukan pada densitometer. Biasanya dipakai monokromator kisi difraksi 1200 garis/mm.
Detektor PMT Photo Multiplier Tube = Tabung Penggandaan Foto) merupakan detektor umum yang dipakai pada densitometer.
D. APLIKASI
Metode KLT-Densitometridigunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif.
Analisis Kualitatif
Analisis kualitatif dengan KLT-Densitometri pada prinsipnya mengacu kepada nilai Rf (Retardation factor) atau Faktor retardasi yaitu : membandingkan Rf analit dengan Rf baku pembanding atau membandingkan bercak kromatogram sample dengan kromatogram "Reference Standart" yang dikenal dengan : Factro Retensi Relatif (Rx)
Untuk penentuan kualitatif dengan Rs harus dilakukan bersamaan dengan sample pada pelat yang sama.
Analisis Kuantitatif
Analisis kuantitatif hampir sama dengan spektrofotometri, penentuan kadar analit dikorelasikan dengan area bercak pada pelat KLT.
Cara penetapan kadar dapat dilakukan dengan :
1. Membandingkan area bercak analit dengan area bercak baku pembanding yang diketahui konsentrasinya.
Cx = Ax / Ap x Cp
Cx = konsentrasi analit
Ax = area analit
Ap = area baku pembanding
Cp = konsentrasi baku pembanding
2. Kurva kalibrasi :
Kurva kalibrasi dibuat dengan cara memplot area bercak terhadap konsentrasi dari satu seri larutan baku pembanding. Kurva yang tebentuk harus linear, kemudian dengan persamaan garis regresi dapat ditentukan kadar analit.
Video di atas adalah video Thin Layer Chromatography ;)
